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本试剂盒可从≤20mg动物软组织(肝脏、脾脏、肾脏，脑等)中快速提取总RNA。试剂盒基于硅胶柱纯化技术，提取过程中无需使用DTT及β-巯基乙醇，整个提取过程可在30min内完成。试剂盒结合DNA过滤技术，可高效地过滤去除基因组DNA，提取的总RNA纯度高，无蛋白和其它杂质的污染，可用于RT-PCR、Northern Blot、Poly A纯化、RNase保护分析和体外翻译等实验。

• 操作简便：30min内完成数个样品的总RNA提取；
  
• 高效去除基因组DNA：独特的基因组DNA过滤柱，无需DNase处理；
  
• 安全低毒：无需DTT及β-巯基乙醇等有毒试剂；
  
• RNA纯度高：提取的RNA无杂质残留，适用于对纯度、完整性要求很高的下游实验。

• 第一次使用前应在漂洗液Buffer FRW1中加入48mL的无水乙醇。
  
• 使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染，经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌、汗液及RNase等，可能导致RNA降解。
  
• RNA在裂解液Buffer FRL中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗、灭菌。
  
• 配制溶液应使用RNase-Free ddH2O。
  
  将水加入干净的玻璃瓶中，加DEPC至终浓度为0.1%(V/V)，混匀放置过夜后高压灭菌。

• 每10～20mg组织加350μL Buffer FRL，用电动匀浆器将组织彻底匀浆，然后加入10μL Proteinase K，混匀后室温放置5min。
  
  脾脏组织建议使用5mg，肌肉类的组织可以增加到50～100mg。
• 12000rpm(~13400×g)离心2～5min，取上清。
  
• 把RNase-Free ColPure gDNA过滤柱放在2mL收集管中，把细胞裂解液或组织上清液转移至gDNA过滤柱中，12000rpm离心30s，保留滤液。
  
  组织裂解液需高速离心去除杂质，细胞碎片会引起柱子的堵塞。处理某些样品时，离心后裂解液表面还可能会有一层脂类层，转移上清液尽量不要吸到这些物质。若gDNA过滤柱堵塞，可将滤液吸出加入适量裂解液匀浆后再转移至新的gDNA过滤柱中。
• 丢弃gDNA过滤柱，滤液中加入等倍体积70%乙醇，用移液枪吸打3～5次。
  
• 把RNase-Free ColPure RNA吸附柱放在2mL收集管中，将溶液和沉淀一起转移至吸附柱中。12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，把吸附柱放回收集管中。
  
• 如不进行DNase I消化，加入700μL Buffer FRW至吸附柱上，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，把吸附柱放回收集管中。
  
• 可选步骤：若后续实验对RNA纯度比较严格，可选择使用DNase I（需另外订购）进行膜上DNase消化。
  
  • 向RNase-Free吸附柱中加入350μL Buffer FRW，12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
    
  • 向吸附柱中央加入DNase I工作液，室温放置15min。
    
  • 向RNase-Free吸附柱中加入350μL Buffer FRW，12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
• 加入500μL Buffer FRW1（使用前请先检查是否加入乙醇）至吸附柱中，室温静置2min，12000rpm离心30s，倒掉废液，把吸附柱放回收集管中。
  
• 重复步骤8。
  
• 12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱置于室温开盖放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液。
  
  此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液的残留，可能会影响后续的RT等实验。
• 将吸附柱转移至新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30～100μL RNase-Free ddH2O，室温静置2min，12000rpm离心2min，得到RNA溶液，将洗脱的RNA溶液置于-80℃保存。
  
  洗脱缓冲液体积不应少于30μL，体积过小影响回收效率。

• 柱子出现堵塞？
  
  • 样品过量。裂解液粘稠，减少样品量或加大裂解液用量，样品量过多反而会降低产量和纯度。
    
  • 裂解液离心不充分。组织裂解液需高速离心去除杂质，杂质会引起柱子的堵塞，转移上清液尽量不要吸到杂质。
    
  • 离心温度过低。本制品使用操作均在室温下进行。
• RNA提取过程中gDNA过滤柱堵塞？
  
  • 增加离心次数、时间或转数。
    
  • 可将滤液吸出加入适量裂解液匀浆后再转移至新的gDNA过滤柱中。